第二幕
白日與黑夜——夜與幽會
康瓦爾（Kornwall），位於英格蘭西南岸
馬克國王的城堡花園，夜間幽會與被伏擊現場
第一景 布蘭甘妮的警告【白話劇情：布蘭甘妮的警告】
夜幕降臨，布蘭甘妮警告梅洛可能暗中窺伺，並懊悔當日調換藥酒。伊索德卻深信愛情的力量，將命運交付愛神，堅決熄滅火炬，迎接崔斯坦到來。
第二景 愛之黑夜【白話劇情：愛之黑夜】
崔斯坦與伊索德重逢相擁，傾訴長久離別之苦。他們將白日視為欺瞞與分離的根源，將黑夜視為愛情的歸宿，渴望擺脫姓名、生死與世界，在永恆的愛中合而為一。
第三景 馬克國王的悲嘆【白話劇情：馬克國王的悲嘆】
布蘭甘妮的警告聲響起，但沉醉於愛情的兩人未能察覺危機。馬克國王在梅洛帶領下突然現身，當場揭發兩人的私情。馬克國王悲痛質問崔斯坦為何背叛自己的信任與情誼，崔斯坦表示答案無法言說。他轉向伊索德，邀她同行前往黑夜之國；伊索德答應相隨。梅洛憤而挑釁，崔斯坦拔劍迎戰。